干货 | 常见病毒灭活/去除工艺盘点及解读

干热处理是在制品冻干后进行的热处理。该技术处理温度为60~100℃，持续时间为30min~4d，需要加入稳定剂，防止蛋白过度变性。一般，温度越高，病毒灭活时间越短。影响干热法病毒灭活效果的因素有很多，如制品中组分/蛋白质浓度/冻干稳定剂成分和浓度的差异，制品最终容器的大小/分装量/冻干曲线和封口形式的差异等，因此，实际生产过程需要严格操作。

巴氏消毒法是指在60±0.5℃的环境下，将蛋白质溶液进行连续加热处理（≥10小时），从而破坏病毒蛋白质及核酸分子结构，使其因变性而无法复制，从而失去传染性。该方法所采用的高温条件会使制品中蛋白产品过度变性，因此需要加入稳定剂以保护蛋白聚合及功能活性。

S/D（solvent/detergent）法是指利用有机溶剂和非离子表面活性剂的组合分解脂包膜病毒的类脂膜，破坏脂包膜病毒的类脂膜，类脂从病毒表面脱落，使病毒失去粘附和感染细胞的能力来达到灭活病毒的效果。

有机溶剂常用磷酸三丁酯（TNBP）；非离子表面活性剂如Triton X-100或Tween80，有报道也用Triton X-45等。S/D处理可以灭活脂包膜病毒，对非脂包膜病毒无效。

使用S/D灭活，下游必须有工艺能够把S/D试剂去除，另外S/D试剂对动物细胞有较强毒性，会影响指示病毒滴度测定检测限，因此该工艺的验证需要尽可能提高加入指示病毒的初始滴度或提高病毒检测方法的灵敏度。

低pH孵放法是重组蛋白药物纯化工艺中常用的关键步骤，其操作过程简单、病毒灭活效果好，其利用有脂包膜类病毒的囊膜和病毒衣壳蛋白在低pH条件下会逐渐变性而使病毒颗粒失去感染能力，从而达到病毒灭活效果。

低pH孵放不仅可以灭活有脂包膜类病毒，还可以沉淀HCP、DNA等杂质，对纯化工艺中的杂质去除也起到重要作用。本方法对于无脂包膜类病毒则作用微弱，但在工艺中的低pH（如pH4）处理（有时加胃酶）能灭活几种脂包膜病毒。除此之外，病毒灭活效果还可能受pH值、孵放时间和温度、胃酶含量、蛋白质浓度、溶质含量等因素影响，灭活效果随着pH升高灭活效果降低，随着温度升高灭活效果升高。

柱层析法（也称色谱）根据蛋白质的理化性质的不同，进行蛋白分离纯化，从而有效分离杂蛋白及消除病毒等污染物。柱层析法包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、反相层析等。使用亲和层析去除病毒主要依靠病毒在亲和填料中和其他非目标蛋白的杂质发酵液成分一起流穿，并且不受填料寿命的影响。

离子交换层析去除病毒的能力主要是以静电作用为主导作用，以阴离子层析（流穿模式）为例，在缓冲液为中性或弱碱性（如pH8.0）条件下，病毒带负电荷，可以和填料带正电荷的季铵阳离子结合，从而结合到层析填料上，而目的蛋白则流穿，最终达到病毒去除的作用。

病毒膜过滤是利用病毒和蛋白大小的不同，使小于平均孔径的蛋白通过滤膜，将大于平均孔径的病毒截留在膜内，从而达到去除病毒的效果。

病毒去除膜过滤可以同时满足病毒去除效果好、目的蛋白质通过性高(回收量、过滤时间)、目的蛋白质不变性的特点，另外不管是脂包膜病毒还是非脂包膜病毒,无论病毒基因组是 RNA还是DNA，基本靠孔径大小来去除病毒，所以是当前最可靠的病毒去除技术。根据目的蛋白的大小，可以选择平均孔径不同的滤膜，其中平均孔径为20nm左右的产品被称为细小病毒滤膜。平均孔径 35~ 50 nm的滤膜被称为逆转录酶病毒滤膜。

根据PDA Technical Report 41，高TMP（跨膜压差）是病毒过滤的最劣条件之一。近年来的报告表明，过滤过程中的压力释放以及之后的再加压会影响病毒去除效果。

不同的病毒灭活/去除工艺有着不同的优劣势与应用领域，实际生产中，应根据潜在污染病毒的特性，结合产品特性和生产工艺、病毒清除工艺的作用机制和清除能力的综合评估，选择适宜的病毒清除工艺。

武汉珈创生物技术股份有限公司，创建于2011年，是一家集生物技术服务与研发为一体的高新技术企业，专注于为生物药品/制品的生产企业及研发机构提供各类细胞（含重组细胞、干细胞、免疫细胞等）及原辅料的质量检测、病毒清除工艺验证技术服务。

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符合法规：依据中国药典2020年版、国药监注、国家食品药品监督管理局、ICH、USP等相关要求进行技术服务，包括《生物制品病毒安全性控制》、《动物源性医疗器械病毒灭活/去除有效性验证的原则》、Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or AnimalOrigin. 1999. ICH Q5A（R1）、Design, Evaluation, and Characterization of Viral Clearance Procedure.2016. USP General Chapter: <1050.1>等。